大疱性类天疱疮的水疱液来源的外泌体的促炎

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大疱性类天疱疮是一种自身免疫性炎性疾病，其特征在于存在抗大疱性类天疱疮自身抗原的自身抗体，导致皮肤-表皮分离并伴随起泡形成。然而，水疱液组分是否以及如何加剧大疱性类天疱疮的进展尚不清楚。外泌体是从细胞释放到体液中的纳米尺寸的囊泡，它们可以在整个身体内传递信号。在本研究中，我们从大疱性类天疱疮患者的疱液中分离和鉴定了外泌体，评估了它们的促炎性作用，并确定了其基本分子机制。我们发现从大疱性类天疱疮患者的疱液中分离的外泌体显示了预期的大小并表达了标记蛋白CD63、CD81和CD9。此外，泡状液衍生的外泌体被人原代角质形成细胞内化，诱导产生关键的炎性细胞因子和趋化因子。蛋白质印迹分析显示，在用泡状液衍生的外泌体刺激后，人原代角质形成细胞中ERK1/2和STAT3信号传导途径强烈和快速活化。我们还发现疱液衍生的外泌体通过体外上调CXCL8间接诱导嗜中性粒细胞运输。此外，CD63主要定位于皮肤损伤中的角质形成细胞和浸润的粒细胞，表明这些细胞是疱液中外泌体的可能来源。使用质谱法，我们分析了泡状液衍生的外泌体的蛋白质组，并鉴定了涉及炎症和免疫应答的各种蛋白质。总之，我们的发现提供了强有力的证据，表明泡状液衍生的外泌体参与了与大疱性类天疱疮相关的皮肤局部自体炎症反应。

Fig1

疱液（BF）衍生的外泌体的特征。（A）大疱性类天疱疮患者的紧张性水疱和糜烂。（B）基于差速超速离心的外来体纯化程序的流程图。（C）来自BF的纯化的外体的电子显微照片。比例尺，纳米。（D）蛋白质印迹证实BF衍生的外泌体中存在外泌体标记蛋白CD9，CD63，CD81，HSP70和GM。（E）纳米颗粒追踪分析（NTA）的代表性结果表明在BF衍生-外来体的稀释样品中具有相似的尺寸分布。

Fig2

疱液（BF）衍生的外泌体促进人原代角质形成细胞中细胞因子和趋化因子的释放。（A）用DiI红膜染料染色的BF衍生的外泌体。将外来体加入在5％CO2培养箱中温育0,3,12或24小时的人原代角质形成细胞中。细胞核用Hoechst（蓝色）复染。比例尺：50微米。（B）将人类原代角质形成细胞与吸引泡起源的外来体（Con）和BF衍生的外来体（20μg/ml）一起温育24小时。通过RT-qPCR测量TNF，IL6和CXCL8的mRNA水平。（C）通过ELISA分析细胞培养上清液中TNF-α，IL-6和CXCL8的蛋白质水平。所有值均以平均值±SD表示。*p0.05;**p0.01，***p0.。

Fig3

疱液（BF）衍生的外泌体激活ERK1/2和STAT3信号传导途径。（A）原代人角质形成细胞的蛋白质印迹分析显示用BF-衍生的外体刺激后ERK1/2和STAT3的强烈和快速激活。（B）从人类原代角质形成细胞刺激5分钟后，从四个不同的患有大疱性天疱疮激活的ERK1/2和STAT3磷酸化的患者中分离的BF衍生的外泌体。（C）ERK1/2和STAT3在外来体刺激的角质形成细胞中的核易位。比例尺=50μm。（D）用ERK1/2或STAT3磷酸化抑制剂PD或S3I-预温育（60分钟）阻止用BF-衍生的外体刺激的原代人角质形成细胞中的ERK1/2或STAT3磷酸化5分钟。（E）使用ELISA来评估PD和S3I-对外来体刺激的角质形成细胞分泌的细胞因子的抑制作用。与零时间点（A）相比，未处理（B）或相对于BFExo（E），*p0.05，**p0.01和***p0.。

Fig4

来自疱液（BF）的外来体在体外通过CXCL8间接诱导人嗜中性粒细胞迁移。（A和B）Transwell实验用于确定嗜中性粒细胞的迁移。允许来自患有大疱性类天疱疮患者的总共1×个外周嗜中性粒细胞迁移45分钟。通过计数下室（图A）中细胞的数量和下Transwell膜（图B）的结晶紫染色来确定趋化效应。（C和D）与PD或S3I-预温育后评估来自患有大疱性类天疱疮患者的嗜中性粒细胞的迁移。通过计数下室（图C）中细胞的数量和下Transwell膜（图D）的结晶紫染色来确定趋化作用。*p0.05，**p0.01和***p0.。

Fig5

疱液（BF）衍生的外泌体的蛋白质组学分析。（A）维恩图显示来自BF衍生的外来体和吸疱衍生的（Con）外泌体的总蛋白。数字表示在各自重叠区域和非重叠区域中的不同蛋白质。（B）来自BF的外泌体的基因本体富集分析。直方图表示生物过程的分配分类。（C）维恩图显示来自BF，尿，血浆和唾液外泌体的总蛋白质。

Fig6

疱液（BF）衍生的外泌体的细胞原始。（A）角质形成细胞标记物K1和CD63的共定位，（B）嗜酸性粒细胞标记物MBP和CD63，（C）嗜中性粒细胞标记物MPO和CD63以及外来体标记物CD63。A，B和C分别以×40（比例尺=μm）和×60（比例尺=50μm）放大率显示。

讨论

这项研究确定了BF来源的外泌体，并证实这些外来体参与了BP的病变炎症反应。从BP患者的BF中分离出外来体，并证明这些外泌体显著增加角质形成细胞中促炎细胞因子IL-6，TNF-α和CXCL8的分泌，数据表明BF衍生的外泌体通过在角质形成细胞中诱导促炎细胞因子和趋化因子的产生而促成BP的发病机制，导致进一步的嗜中性粒细胞活化和募集，产生自体炎症扩增环，从而引起更严重的局部炎症反应。

文章来源：FangH,ShaoS,JiangM,etal.Proinflammatoryroleofblisterfluid-derivedexosomesinbullouspemphigoid[J].JPathol,8,(1):-.

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