北大疱病点评天疱疮IgG自身抗体直接

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寻常型天疱疮和落叶型天疱疮IgG自身抗体直接阻断桥粒芯糖蛋白和桥粒芯胶蛋白之间的嗜异性反式相互作用

KenIshii1*,KenjiYoshida1,JohnRStanley2,JunYamagami3,MasayukiAmagai3,AkiraIshiko1

1DepartmentofDermatology,TohoUniversitySchoolofMedicine,Tokyo,Japan

2DepartmentofDermatology,UniversityofPennsylvania,Philadelphia,PA

3DepartmentofDermatology,KeioUniversitySchoolofMedicine,Tokyo,Japan

JInvestDermatol.Mar3;S-X(20)-7.

doi:10./j.jid..02..

皮肤病学著名期刊JournalofInvestigativeDermatology（JID）近日在线发表了一篇关于天疱疮IgG自身抗体致病方式的论著（JIDdoi:10./j.jid..02..）。今天我们来一起学习吧！

写在前面：

本文主要为医学专业人士准备，阅读有困难的患者朋友可直接阅读文末“致患者朋友的话”版块。

全文约字，阅读大概需花费25分钟。

作者介绍

摘要

引言

材料和方法

统计分析

结果

讨论

疱病小评

致患者朋友的话

文章较长，打开背景音乐细细品读吧！

主

要

作

者

石井健

石井健KenIshii

东邦大学医学院皮肤科，副教授，本文第一作者兼通讯作者

曾与-2年在庆应义塾大学医学部与天谷雅行教授共同研究自身免疫性大疱病。

主要研究领域：天疱疮水疱产生机制，天疱疮抗体的病理活性测定

JohnR.Stanley

JohnR.Stanley

宾夕法尼亚大学皮肤科，教授

既往研究成果：

确定了天疱疮的自身抗原

目前研究方向：

通过克隆天疱疮患者的单克隆抗体来表征自身抗体反应

天疱疮的致病性和非致病性抗体

天谷雅行

天谷雅行MasayukiAmagai

庆应义塾大学医学部教授，医学博士

日本皮肤科学会理事长

既往研究成果

利用杆状病毒表达系统创建了重组Dsg蛋白

研发了天疱疮的血清学诊断ELISA试剂盒

构建天疱疮小鼠模型

目前研究方向：

自身反应性T细胞、调节性T细胞在天疱疮发病过程中的病理生理

天疱疮小鼠模型的调节性T细胞分析

产生自身反应性B细胞的转基因小鼠

1.摘要

寻常型天疱疮（pemphigusvulgaris，以下简称PV）和落叶型天疱疮（pemphigusfoliaceus，以下简称PF）中的抗桥粒芯糖蛋白（desmoglein，以下简称Dsg）的自身抗体（antibodies，抗体，以下简称Abs）造成桥粒附着力的丧失而引起水疱。

水疱的形成是由于对Dsg的直接抑制，还是由于细胞内信号事件引起桥粒不稳定，或者两者兼而有之，还一个有争议的问题。

Dsg和Dsc（desmocollin，桥粒芯胶蛋白，下同）之间的结合是桥粒的基本黏附单元，为消除细胞对天疱疮抗体致病性的影响，开发了用重组Dsg1，Dsc1，Dsg3或Dsc3胞外域包被的微珠测定法。（编者按：此举排除细胞对抗体结合的影响，单纯研究抗原抗体间的作用）

Dsg微珠和Dsc微珠的混合物形成大的聚集体，证实了嗜异性结合是主要的结合方式。

（编者按：因原文中并未给出明确解释，编者科普一下“嗜同源性”“嗜异性”“反式”“顺式”的概念：同源性强调构成蛋白质的氨基酸序列和蛋白质功能具有相似性，而反式顺式强调的是位于细胞相对侧还是相同侧。那么：

嗜同源性：即在桥粒芯糖蛋白之间

嗜异性：在桥粒芯糖蛋白与桥粒芯胶蛋白之间

反式（trans）：在相对细胞上的分子之间

顺式（cis）：在同一细胞上的分子之间）

结合跨黏附界面的致病性抗Dsg1和抗Dsg3单克隆抗体（monoclonalantibody，mAb，下同）分别阻止Dsg1/Dsc1和Dsg3/Dsc3珠的聚集，而非致病性mAb则没有。

处于活动期的PF和黏膜型PV患者的血清Dsg1/Dsc1和Dsg3/Dsc3微珠的粘附具有抑制作用，并且活动期抑制作用优于缓解期。

这些发现强烈证明，Dsg和Dsc之间的嗜异性相互作用的空间位阻对于PF和PV的疾病机制很重要。

2.引言

天疱疮是一种发生于皮肤和/或黏膜的自身免疫性大疱病，其病理特征为自身抗体IgG与桥粒芯糖蛋白结合，导致角质形成细胞的细胞间黏附能力丧失，出现棘层松解，进而发展为水疱(StanleyandAmagai,)。

寻常型天疱疮（PV）和落叶型天疱疮（PF）是天疱疮的两个主要亚型，其特征分别是机体产生了针对Dsg3（黏膜型PV，皮肤黏膜型PV）和Dsg1（PF，皮肤黏膜型PV）的自身抗体。PV表现为皮肤和粘膜的基底层上的水疱，而PF表现出皮肤的棘细胞层上的水疱。

目前天疱疮水疱形成机制仍存在争议。主要有两种学说。

一种是空间位阻学说，即病原性自身抗体直接干扰Dsgs的反式或顺式相互作用，导致细胞间粘附的丧失(DiZenzoetal.,,Payneetal.,,Sekiguchietal.,,Tsunodaetal.,)。

另一种机制是自身抗体引起细胞内信号传导相关的细胞应答（包括Dsg的内化和降解）。例如p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK），Rho家族GTPase，蛋白激酶C和磷脂酶C(Berkowitzetal.,,Esakietal.,)的参与。

Dsg和Dsc是位于桥粒的细胞黏附分子钙黏蛋白，它们初始是无活性的前体形式，被前蛋白转化酶如furin蛋白酶切割，变为成熟的活性功能形式（Posthausetal.,,Yokouchietal.,）。在细胞外，Dsgs由四个结构域EC1-EC4（每个结构域由约个氨基酸的钙黏蛋白重复序列组成）和近膜锚（EA）组成。EC1的氨基末端区域对黏附功能很重要。

直到现在，桥粒钙黏蛋白之间的黏合在分子水平上还没有得到很好的认识，特别是在Dsg和Dsc是嗜异性还是嗜同源性结合方面(NieZ.JBC,ChitaevJCB)。

早期研究使用转染了Dsg和Dsc的L细胞(Getsiosetal.,,Marcozzietal.,,Tselepisetal.,)和基因敲除小鼠(Chenetal.,,Kochetal.,)表明Dsg和Dsc对于正常细胞的黏附都是必需的。

最近，Harrison等人确定了Dsg2和Dsg3以及Dsc1和Dsc2的胞外域晶体结构。这些作者在生物物理分析和微珠聚集试验中进一步表明，Dsg和Dsc的嗜异性相互作用对桥粒黏附单元很重要。

Evangelista等人通过微珠凝集试验证实了Dsg1-Dsc1黏附的重要性，并展示了巴西落叶型天疱疮（fogoselvagem，以下简称FS）血清对这种黏附的抑制作用(Evangelistaetal.,)。

本研究旨在进一步描述Dsg–Dsc微珠凝集法，并分析PV和PF自身抗体是否会阻断Dsg3/Dsc3和Dsg1/Dsc1的嗜异性相互作用。

3.材料和方法

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准备抗Dsg1单克隆抗体和抗Dsg3单克隆抗体

通过噬菌体展示法从PF患者中分离出两种Dsg1scFv（单链可变区片段）抗体(Ishiietal.,)，从scFv转化得到的三种抗Dsg1IgGmAb(Yoshidaetal.,)(附加表1)。

附加表1：抗dsg1单克隆抗体的表位与致病性

如先前所述(Kawasakietal.,,Tsunodaetal.,)，制备鼠抗人/鼠Dsg3的AK和NAK系列单克隆抗体。表位和致病性见附加表2。

附加表2：抗dsg3单克隆抗体的表位与致病性

2

准备患者血清

获得了8名PF患者和8名黏膜型PV患者的血清。PF和PV根据临床特征，组织病理和免疫荧光检查确诊，我们选择了临床活动期的血清。

我们纵向比较了6例PV和7PF患者的活动期血清和非活动期血清。临床信息见附加表3和4。

附加表3：进行纵向研究的PF病例

附加表4：进行纵向研究的PV病例

3

制备重组Dsg1、Dsc1、Dsg3和Dsc3质粒

补充材料和附加表5中提供了构建质粒的详细步骤。

包括以下几种重组质粒：

1）Dsg1-Fchis重组蛋白，结构包括：信号肽（S）、前序列（P）、四个胞外结构域（EC1-EC5），然后是人IgG1的Fc区和histag。

2）重组?p-Dsg1-Fchis，?p-Dsc1-Fchis，?p-Dsg3-Fchis，?p-Dsc3-Fchis：免疫球蛋白结合蛋白（BiP）的信号肽，人IgG1的Fc区、histag、Dsg1，Dsc1，Dsg3或Dsc3的EC1-EC5。

附加表5：用于重组Dsg和Dsc质粒构建的引物

4一

微珠分析法

1)DynabeadsproteinG微珠用重组Dsg1、Dsc1、Dsg3或Dsc3包被，分别在4℃下旋转过夜。

A.当时用重组Dsg1andDsc1时：μl?p-Dsg1Fchis/?p-Dsc1Fchis+0.2μlproteinGdynabeads

B.当时用含有重组Dsg和Dsc的培养液时：μl?p-Dsg1Fchis/μl?p-Dsc1Fchis/μl?p-Dsg3Fchis/50μl?p-Dsc3Fchis+0.2μlproteinGdynabeads

2)bindingbuffer清洗微珠，后加入过量的人骨髓瘤IgG1lambda封闭微珠

3)清洗微珠，将Dsg1微珠和Dsc1微珠或Dsg3微珠和Dsc3微珠以相等的比率混合在凹陷载玻片上。

4)微珠混合物加入相应单克隆抗体或病人血清，旋转30分钟

5)通过OlympusBX63显微镜收集图像

使用cellSens（Olympus）对珠子聚集进行定量，对图像进行阈值处理并检测到聚集物，聚集体的面积近似为粘合性能，计算10个最大聚集体的平均值(+SEM)。

计算抑制百分比=[1-聚集面积（×）/聚集面积（对照）]×

4.统计分析

使用Mann-WhitneyU检验比较PF和PV血清在活跃阶段和非活跃阶段之间的抑制百分比。

5.结果

结果1

Dsg1和Dsc1的成熟形式对于细胞黏附是必需的

因为既往(Yokouchietal.,)报道致病性抗Dsg1mAb结合成熟形式的Dsg1，所以我们假设Dsg1的成熟形式对于珠子聚集是必需的。

用重组的成熟Dsg和Dsc包被微球进行聚集分析：首先，设计Dsg1和Dsc1的整个细胞外域结构，包括前序列、人类IgG1的Fc区域、Histag（图1），并在哺乳动物表达系统中表达（附加图1）。纯化后，将重组Dsg1-Fchis和Dsc1-Fchis包被在蛋白G微珠上。

图1：用于微珠测定的重组蛋白的分子结构

1）Dsg1Fchis和Dsc1Fchis重组蛋白的分子，包括：信号肽（S）、前序列（P）、四个胞外结构域（EC1-EC4），细胞外锚定结构域（EA），然后是人IgG1的Fc区和histag。

2）重组?pDsg1Fchis，?pDsc1Fchis，?pDsg3Fchis，?pDsc3Fchis：免疫球蛋白结合蛋白（BiP）的信号肽，人IgG1的Fc区、histag、Dsg1，Dsc1，Dsg3或Dsc3的EC1-EC4和细胞外锚定结构域（EA）。

附加图1.重组Dsg1，Dsc1，Dsg3和Dsc3胞外域由哺乳动物表达系统产生

用?pDsg1-Fchis，?pDsc1-Fchis，Dsg1Fchis，Dsc1-Fchis，?pDsg3-Fchis和?pDsc3-Fchis质粒转染FT细胞，将培养基上清液在SDS-PAGE上分离并通过HRP标记的抗人IgG检测。可见重组蛋白被有效地产生并分泌到培养基中

为增加Dsg1和Dsc1的成熟形式，用furin蛋白酶处理Dsg1和Dsc1微珠。如附加图2所示，furin蛋白酶处理增强了Dsg1微珠和Dsc1微珠混合物的聚集，表明Dsg1和Dsc1的成熟形式是聚集所必需的。

附加图2.Furin蛋白酶处理增强了Dsg1和Dsc1珠的聚集：

分别用Dsg1-Fchis和Dsc1-Fchis包被proteinG。将Dsg1珠和Dsc1珠混合后，让它们聚集30分钟。然后用前蛋白转化酶furin处理Dsg1和Dsc1微珠，以增加成熟形式的数量。经furin处理的Dsg1/Dsc1微珠形成较大的聚集体。

结果2

Dsg和Dsc的嗜异性结合是主要的黏附方式

为了以更有效的方式获得成熟形式的Dsg和Dsc重组蛋白，我们设计了缺少前序列的Dsg1，Dsc1，Dsg3和Dsc3胞外域的构建体，将其与IgG1的Fc区和histag融合(?p-Dsg1-Fchis,?p-Dsc1Fchis,?p-Dsg3-Fchis,和?p-Dsc3-Fchis;图1)。重组蛋白在哺乳动物表达系统中产生，并分泌到培养基中（附加图1）。纯化后，将重组Dsg1-Fchis和Dsc1-Fchis包被在proteinG微珠上。

验证重组蛋白具有适当的天然构象：通过与重组Dsg1蛋白（?p-Dsg1-Fchis）预孵育，可免疫吸附4种PF血清对人体皮肤的免疫反应性（附加图3）。同样，通过与重组Dsg3蛋白（?p-Dsg3-Fchis）预孵育，可免疫吸收7种PV血清对Dsg3ELISA的免疫反应性。

附加图3：用?pDsg1Fchis和?pDsc1Fchis进行免疫吸附测定。

将4份PF血清用含?pDsg1Fchis或?pDsc1Fchis的培养基（仅培养基）孵育，并在正常人皮肤上进行免疫荧光染色。可见通过与?pDsg1Fchis孵育可以去除PF血清的所有免疫反应性。Bar,50μm。

我们将Dsg或Dsc胞外域包被在proteinG微珠上，并进行聚集测定。

涂有Dsg1，Dsc1，Dsg3或Dsc3的珠子仅显示出极小的聚集。

相反，Dsg1珠和Dsc1珠的混合物以及Dsg3珠和Dsc3珠的混合物形成较大的聚集体（图2）。

这些数据证实了Dsg1/Dsc1和Dsg3/Dsc3之间的异嗜性相互作用在黏附力上优于嗜同种性相互作用。

在后续实验中，使用了缺少序列的重组Dsg1，Dsc1，Dsg3和Dsc3。

图2.Dsg和Dsc的异嗜性相互作用是粘着力的主导因素。

?p-Dsg1Fchis或?p-Dsc1Fchis（a）和?p-Dsg3Fchis或?p-Dsc3Fchis（b）分别包被在proteinGdynabeads上。

将Dsg1珠和Dsc1珠（a）和Dsg3珠和Dsc3珠（b）混合后，使珠聚集30分钟。

请注意，Dsg1和Dsc1珠粒与Dsg3和Dsc3珠粒的混合物形成大的聚集体，而仅涂有Dsg1，Dsc1，Dsg3或Dsc3的珠粒仅显示出最小的聚集。

结果3

致病性抗Dsg1和抗Dsg3单克隆抗体阻断了Dsg1/Dsc1和Dsg3/Dsc3的体外相互作用

为了确定天疱疮自身抗体是否可以直接阻断Dsg/Dsc的黏附，我们首先检测了从PF患者中分离的抗Dsg1单链抗体scFv（噬菌体展示法），通过器官培养人体皮肤注射试验（Ishiietal.,）（附加表1）很好地描述了Dsg1scFv的致病活性。

致病性PF1-8-15Ab识别EC1的构象表位，它是Dsg1的假定黏附界面(Yokouchietal.,)。

非致病性抗体PF1-2-6结合Dsg1EC3域上的线性表位。

致病性抗Dsg1scFvs（PF1-8-15）阻止了Dsg1/Dsc1珠的聚集（图3a）。

但是，非致病性抗Dsg1scFv（PF1-2-6）和无关的mAb并非如此。

这些数据表明，克隆的致病性PF单价体和单克隆抗体能够阻断Dsg1/Dsc1嗜异性互作，并且不需要细胞信号传导或针对Dsg1的多克隆抗体。

为了排除scFv形式的天疱疮抗体可能产生假性结果，使用抗Dsg1scFvs的IgG形式，致病性scFv的二价IgG形式与单价scFv形式一样，阻断了Dsg/Dsc微珠的粘附。非致病性抗Dsg1IgG（PF1-2-6）不能抑制聚集（图3b）。

接下来，我们分析了这些抗体的混合物是否改变了结果（图3b）。致病性和非致病性mAb的混合物可以抑制聚集。但即使将非致病性抗Dsg1单克隆IgG抗体混合也不能抑制聚集。

接下来，为了分析抗Dsg3抗体的抑制作用，我们使用先前从PV模型小鼠中分离的小鼠抗Dsg3单克隆抗体，其致病活性已通过新生小鼠注射或培养角质形成细胞进行体外分离试验验证(Kawasakietal.,,Tsunodaetal.,)。mAb表位显示在附加表2中。

结合EC1域构象表位的致病性抗Dsg3IgGmAb（AK23，NAK1，NAK4和NAK9）阻止了Dsg3/Dsc3聚集。

致病性AK19识别AA87-（EC1和EC2的一部分）显示出微弱的抑制作用。识别Dsg3（AK15，AK18）胞外域中间部分的非致病性抗Dsg3mAb不会阻止Dsg3/Dsc3聚集。

这些数据表明，Dsg3/Dsc3微珠检测可以区分致病性抗Dsg3和非致病性抗Dsg3mAb（图3c）。

图3.致病性抗Dsg1和抗Dsg3mAb分别阻断了Dsg1/Dsc1和Dsg3/Dsc3的嗜异性相互作用

（a，b）在所示的抗Dsg1scFv和IgGmAb的存在下，混合Dsg1珠和Dsc1珠。

（a）测量了PFScFv形式的mAb和无关的AM3-13scFv。致病性PF1-8-15scFv阻止了聚集，但非致病性PF1-2-6scFv没有。

（b）测量了所示的mAb的IgG形式。

（c）在所示的抗-Dsg3IgGmAb存在下，混合Dsg3微珠和Dsc3微珠。致病性Abs阻断了Dsg3/Dsc3的粘附。

结果4

所有测试的PF和PV血清均能在体外阻断Dsg1/Dsc1和Dsg3/Dsc3的相互作用

分别使用Dsg1/Dsc1和Dsg3/Dsc3微珠检测法分析了8种PF和8种黏膜型PV的血清。

我们将Dsg1或Dsg3微珠的额外反应设置为对照，以确定IgG本身是否可以通过二价IgG结合形成跨珠子的桥而引起微珠聚集。

一些PF和PV血清分别导致仅Dsg1或Dsg3微珠的弱聚集，可能是由于二价IgG形成了桥。

然而，尽管由于二价IgG导致了这种弱聚集，所有8份PF血清都阻止了Dsg1/Dsc1珠聚集，所有8份PV血清都阻止了Dsg3/Dsc3珠粘附（图4）。直接证明PF和PV血清内的自身抗体可以阻断Dsg和Dsc的嗜异性相互作用，而无需细胞内信号传导或其他细胞过程。

图4.所有8个PF血清和8个PV血清分别阻止了Dsg1/Dsc1和Dsg3/Dsc3嗜异性相互作用而没有细胞内信号传导。

a）8个PF血清和正常对照以及PF1-8-15抗Dsg1IgGmAb处理Dsg1/Dsc1珠（上图）和单独的Dsg1珠（下图）30分钟。所有PF血清均会阻止Dsg1/Dsc1粘附，尽管其中一些会导致仅Dsg1微珠的弱聚集。

b）Dsg3/Dsc3珠（上图）和仅Dsg3珠（下图）的混合物分别用8个PV血清和正常对照以及AK23抗Dsg3IgGmAb处理30分钟。尽管某些PV血清会导致Dsg3/Dsc3单独珠粒的弱聚集，但所有PV血清均会阻止Dsg3/Dsc3粘附。

结果5

天疱疮血清对Dsg/Dsc黏附的抑制作用与疾病活性相关

分析7例PF和6例PV患者，比较疾病活动期和非活动期的血清（附加表3和4）。

我们通过微珠检测不同剂量的配对血清，测量聚集面积并计算聚集抑制率（%）。

附加图4显示了一个代表性的PF病例。随着血清剂量增加，抑制百分率增加，并且在活动期和缓解期均存在阻断性Abs。但是在相同的血清剂量下比较活动期和缓解期，在缓解阶段抑制百分率较低。

附加图4.缓解期PF病人Abs对Dsg1/Dsc1粘附的抑制作用低于活动期

通过微珠法测定PF患者＃1活动期和缓解期的不同剂量配对血清。在活动期和缓解期，随着血清剂量的增加，抑制百分率增加。比较活动期和缓解期，缓解期的抑制百分率较低

在其他6例PF患者中，缓解期抑制率也较低（图5a）。

因此，PF血清对Dsg1/Dsc1黏附的抑制作用与疾病活动性相关。同样，在所有6名PV患者中，非活动期的抑制百分比也低于活动期的抑制百分比（图5b）。

图5.PF血清对Dsg1/Dsc1粘附的抑制作用以及PV血清对Dsg3/Dsc3粘附的抑制作用与疾病活性相关。

分别通过Dsg1/Dsc1和Dsg3/Dsc3微珠检测法分析了7例PF（a）和6例PV患者（b）活跃和非活跃阶段的配对血清。临床信息显示在补充表3和4中。我们测量了10种最大聚集体的面积，并计算了抑制百分率。在所有情况下，非活性期的抑制百分数均较低。

*P0.05;**P0.01;***P0.;ns,notsignificant(p0.05)(Mann-WhitneyUtest)

除PV患者#5外，所有其它病例在缓解期抗Dsg1或抗Dsg3抗体滴度均下降（附加表4）。

为了分析降低的致病作用是由于自身抗体滴度变化还是致病性抗体与非致病性抗体的比例所致，在相同的自身抗体滴度下对4例PV患者的配对血清进行了比较，这些患者尽管处于非活动期但仍具有较高的抗体滴度，发现非活性期的抑制作用低于活性期（附加图5）。

在大多数情况下，缓解期抑制作用降低可能的主要原因是抗Dsg抗体滴度较低。然而，在于非活动期抗体滴度仍然很高的情况下，例如PV患者＃3-＃6，致病性Abs的比例以及滴度的降低共同导致疾病活动性降低。

附加图5.在非活性期，PV血清中针对Dsg3/Dsc3粘附的抑制性抗体比例降低

通过Dsg3/Dsc3微珠分析，在相同滴度的自身抗体下比较了4例PV病例活动期和非活动期的配对血清（图5b中的患者＃3-＃6）。在所有情况下，在非活动阶段的抑制百分比均较低。

*P0.05;**P0.01;***P0.;ns,notsignificant(p0.05)(Mann-WhitneyUtest)

6.讨论

为了完全消除细胞对天疱疮抗体引起Dsg/Dsc黏附力丧失的潜在影响，我们开发了微珠检测法，由哺乳动物表达系统产生重组Dsg1和Dsc1胞外域以及重组Dsg3和Dsc3胞外域，将其包被在微珠上。

我们证实了先前的发现(Harrisonetal.,)，与Dsg或Dsc的嗜同源性相互作用相比，Dsg和Dsc的嗜异性相互作用在黏附中占主导地位。

我们证明了病原性PF单克隆抗体可以阻断Dsg1/Dsc1的嗜异性相互作用，而无需细胞内信号传导或其他细胞过程。

同样，致病性抗Dsg3mAb可以在没有细胞内信号传导情况下抑制Dsg3/Dsc3黏附。

此外，所有测试的活动性PV和PF患者均具有此类抗体，并且疾病活动分别与黏附抑制作用显著相关。

这些结果表明Dsg/Dsc的嗜异性-反式作用的空间位阻是天疱疮发病的重要机制。

空间位阻是天疱疮病理生理机制之一，已有以下证据表明：

1）病原性天疱疮抗体识别对Dsg相互作用至关重要的EC1区(Ishiietal.,,Payneetal.,,Sekiguchietal.,)；

2）Dsg1和Dsg3敲除小鼠表现出与天疱疮患者相似的水泡(Chenetal.,,Kochetal.,,Kugelmannetal.,)。这些数据表明Dsgs的失活（不论是通过靶向攻击黏附结构域，还是基因敲除）可导致典型的天疱疮病变。

Waschkeetal.报道通过原力显微镜观察，PV患者的纯化IgG阻断了Dsg3嗜同源性相互作用，但两名PF患者的纯化IgG并未阻断Dsg1嗜同源性相互作用，声称PF血清通过细胞信号转导的其他机制引起水疱形成(Heupeletal.,,Vielmuthetal.,,Waschkeetal.,)。

相比之下，本的研究提供了直接的证据，即PF和PV自身抗体可阻断Dsg1/Dsc1和Dsg3/Dsc3反式相互作用而无需细胞内信号传导。由于Dsg的嗜同源性相互作用较弱，因此未评估PF和PV血清对Dsg1的嗜同源性相互作的抑制作用。

Evangelistaetal用与本研究相似的微珠试验表明，Dsg1和Dsc1表现出嗜异性黏附(Evangelistaetal.,)。此外，6份巴西落叶型天疱疮的血清可抑制这种黏附。最后，他们鉴定了大多数FS与Dsg1结合的黏附表位。

我们的发现以多种方式证实并扩展了这些研究：PF自身抗体可能由于空间位阻而导致Dsg1-Dsc1的黏附丧失。PV自身抗体可通过空间位阻引起与Dsg3-Dsc3的粘附丧失。在PF和PV中，粘附的丧失程度与疾病的严重程度有关；在疾病缓解期，即使调整抗Dsg抗体的滴度，PV和PF血清也不会像活动期那样抑制黏附。我们还进一步表征了微珠测定法，以显示Dsg和Dsc的成熟形式对于黏附是必需的。

桥粒钙黏蛋白整个胞外域的晶体结构分析为钙黏着蛋白分子间相互作用提供了机械基础(Harrisonetal.,)。对于反式相互作用，来自一个细胞表面的桥粒钙黏蛋白分子氨基末端的保守色氨酸（Trp2）侧链插入到相对细胞上钙黏蛋白分子氨基末端的疏水口袋中。停靠的Trp2侧链形成疏水相互作用残基Ile/Val24，Try36，Ala80和Leu92（根据Dsc1编号）排列在疏水口袋中，而吲哚氮则与残基90的骨架羰基进行氢键结合。这些Trp2受体位点与致病性抗Dsg1单克隆抗体PF1-8-15(Yokouchietal.,)和致病性抗Dsg3单克隆抗体NAK1和NAK9(Kawasakietal.,)的表位部分重叠。AK23病原性单克隆抗体的表位接近Trp2(Tsunodaetal.,)。因此，这些致病性单克隆抗体可合理地阻止Dsg1/Dsc1与Dsg3/Dsc3之间的嗜异性相互作用。

先前的构象表位图谱显示，PF中大多数Dsg1抗体与Dsg1的氨基末端结合，氨基末端是钙黏蛋白细胞间黏附的关键区域，因为88%的PF血清与Dsg1的EC1结构域结合(Chanetal.,2)。竞争酶联免疫吸附试验（CompetitionELISA）显示，大多数PF血清针对的是致病性PF1-8-15抗Dsg1单抗所定义的相同或附近的表位，该单抗阻断了40份PF血清中29份的20%结合(Yokouchietal.,)。

关于PV血清，通过结构域交换Dsg3/Dsg2分子进行的表位作图显示，个PV血清中有个（91％）与Dsg3的EC1结构域反应，而Dsg3的致病性抗Dsg3mAb的抗原决定簇位于其中(Ohyamaetal.,)。

此外，当用结构域交换分子进行竞争性ELISA检查时，Dsg3的残基1-在25个（72％）PV血清中的18个中吸收了超过50％的免疫反应性，这表明Dsg3的N末端包含PV血清的主要表位（Futeietal，0）。

这些数据与我们的发现一致，即所有测试的PF和PV血清均含有通过空间位阻直接干扰Dsg/Dsc相互作用的抗体。这一结果表明此类抗体是疾病病理生理学的组成部分。

值得一提的是，我们的数据并不排除天疱疮病理生理学的其它机制。

例如，无法评估天疱疮自身抗体对Dsgs顺式黏附相互作用的抑制作用，一些天疱疮抗体已被证明与顺式黏附位点结合(DiZenzoetal.,)。

此外，抗体结合下游的细胞反应，包括内吞作用或细胞信号通路，可能与空间位阻机制一起作用，放大水疱形成(Berkowitzetal.,,Maoetal.,2,Saitoetal.,,Yoshidaetal.,)。

我们的数据表明，微珠分析可用于检测天疱疮患者血清的致病性。

当前，通过ELISA或CLEIA测量的抗Dsg1和抗Dsg3抗体滴度用于评估PF和PV患者的疾病活动性。ELISA或CLEIA可测量针对Dsg1和Dsg3的免疫反应性。

由于微珠测定法是检测Dsg/Dsc的嗜异性-反式相互作抑制作用的功能测定法，因此它将为评估天疱疮的疾病活性提供简单而有价值的实用工具。

特别在缓解阶段，这种微珠测定法仍可以帮助具有高抗体滴度的患者。例如，在PV患者＃5中，抑制率（％）与疾病活动相关，尽管在非活动期抗Dsg3ELISA滴度高于活动期。

总而言之，发现在所有接受测试的患者中，PF和PV自身抗体分别阻止Dsg1和Dsc1之间的嗜异性相互作用以及Dsg3和Dsc3之间的相互作用，而没有细胞信号传导或其他细胞过程，抑制作用与疾病活性相关。这些数据表明Dsg和Dsc相互作用的空间位阻是天疱疮水疱形成的重要机制。

北

点

大

评

自身抗体与桥粒芯抗原的结合可通过多种协同机制引起水疱形成，目前的主流观点是自身抗体介导的空间位阻和/或对桥粒组装的干扰导致了天疱疮的病理生理过程，而细胞信号通路增强了病理性自身免疫反应。病理性抗Dsg3单克隆抗体可以通过顺式和反式作用引起棘层松解。

根据开篇对相关概念的解释，相信读者们不难理解，本文中嗜异性反式即指Dsg和Dsc的异源性细胞间结合。如下图所示。

本研究采用微珠测定法，对嗜异性-反式相互作用进行了进一步验证和探索。

临床上的ELISA试剂盒，将重组Dsg蛋白包被于微孔板中，通过测定抗体滴度判断疾病活动性。但也有这种情况，患者抗体滴度在缓解期仍然长时间维持高水平，这些高滴度的抗体可能为非致病性的自身抗体，但无法通过ELISA方法与致病性抗体区分，而微珠分析法可以测定抗体的致病能力。

期待日后能够研制出可以检测抗体致病性的试剂盒，弥补目前ELISA检测的不足，使得疾病活动性和抗体致病性能够得到更有效的评价。

我们知道天疱疮的发病过程中存在表位扩散现象，可以产生各种致病性与非致病性抗体。临床上一部分PV患者也可以从黏膜型PV转变为黏膜皮肤型PV，或者从PV转变为PF。分子模拟、交叉反应、表位扩散在天疱疮病理生理过程中究竟是何种机制也有待进一步探索。

本文观点为Dsgs与Dscs之间的嗜异性相互作用为桥粒黏结的基础，Dsg和Dsc在维持桥粒稳定方面具有势均力敌的作用，但未解释为何在临床上，天疱疮患者自身抗体以抗Dsg抗体为主，Dsc抗体则非常少见。

目前已有学者报道了抗Dsg抗体阴性但抗Dsc抗体阳性的非典型天疱疮，也有报道了同时具有抗Dsg抗体和抗Dsc抗体的天疱疮。Dsg和Dsc在结构功能、免疫原性及相互作用方面仍然有很多值得研究的地方。

点此亲启

致患者朋友的话

这篇文章的主旨在于，天疱疮自身抗原Dsg和Dsc是通过相互作用彼此黏结在一起，共同维持着皮肤屏障功能的完整和稳定；致病性抗Dsg抗体通过干扰这种相互作用，破坏细胞连接，从导致皮肤出现糜烂水疱，而细胞内部的信号传导并没有起到决定性作用。

我们在临床上经常遇到，通过ELISA检测的Dsg、BP的抗体很高，却没有任何皮肤损害，这种现象对减药就带来了困惑。这些抗体哪些真的致病，哪些并不致病，可以通过文中的方法（微珠测定法）分辨出来，减少患者不必要的治疗。

人体是一个非常缜密的结构，自身免疫性疾病的发生机制尤为复杂，目前的研究仍然处于盲人摸象阶段，医学家希望通过研究天疱疮抗原结构和抗体致病机制，为天疱疮的诊断和治疗提供新的思路。

北大疱病专业组

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